Prokarioti bez stanične stijenke iz razreda Mollicutes kao biljne patogene bakterije, uzrokuju više stotina bolesti na raznim gospodarski i ekonomski važnim biljkama (riža, šećerna repa, kukuruz, krumpir, vinova loza, različite voćne vrste, ukrasno bilje). Genom fitoplazmi je vrlo mali (600.000 baznih parova do 1.200 000 bp); u usporedbi s bakterijskim genomima (Seemüller i sur., 1998.). Pleomorfne su sa varijacijama veličine od 200 do 800 nm. Visoko plastični genomi omogućuju im brzu prilagodbu na nove domaćine, sa ogromnim gubicima prinosa kod ekonomski važnih usjeva. U znanstvenom smislu aktivno se proučavaju. Za otkrivanje fitoplazmi u floemskom tkivu koriste se različite boje koje su specifične za DNK (DAPI, Dienes) uz mikroskopski pregled. U floemu nema biljne DNA koja bi mogla ometati test (Schaper, Seemüller, 1982.). Mogu interferirati druge prisutne bakterije u floemu, te može biti teško identificirati prave stanice floema mikroskopom.
Enzimski imunosorbentni test (ELISA) korišten je za otkrivanje specifičnih mikoplazmi, ali ne sa uvijek uvjerljivim rezultatima (Chen i sur., 1989.). Korštenjem monoklonskih protutijela poboljšala se specifičnost i osjetljivost testa ali je još uvijek teško razivit nove testove npr. za otkrivanje fitoplazmi kod vrste Euphorbia puclherrima. Za otkrivanje velikog broja mikroogranizama te fitoplazmi u posljednjih deset godina koriste se PCR testovi. Nalaze se na granici između virusa i bakterija kao ˵specifični mikroorganizmi˶ slični mikoplazmama (animalnim i ljudskim patogenima), formalnog naziva mikoplazmoliki organizmi- (MLO); (Doi i sur., 1967.). Povezane su sa zarazama preko 700 biljnih vrsta u svijetu. Prenose ih insekti vektori (lisnjaci, psilidi). Insekti koji se hrane floemom iz porodica; Cicadellidae, Cixiidae, Cercopidae, Derbidae, Delphacidae i Psyllidae (Weintraub i Beanland 2006; Linck i Reineke 2019; Quaglino i sur. 2019.; Jakovljević i sur. 2020.).
Nedavne molekularne studije otkrile su jedinstvene biološke značajke fitoplazmi. U zadnjih deset godina bolest je progresirala sa sporadičnim pojavama zaraze, pa sve do epidemioloških razmjera. Primjer u vinogradima su i do 50 % inficiranih trsova ovim patogenom. Širenje fitoplazmoza vinove loze u Hrvatskoj i u svijetu (Europa i Australija) poprima zabrinjavajuće razmjere. Prema iskustvima iz drugih zemalja koja pokazuju da postoji određena cikličnost u progresiji i regresiji zaraze. Epidemija na nekom području obično traje 2-3 godine, a nakon toga dolazi do postupnog smirivanja, što može potrajati i duže vrijeme, također i sa slučajevima ˵samoozdravljenja˶. Ograničene su na floem, a modificiraju ravnotežu biljnih hormona i uzrokuju promjene u morfologiji biljaka. Sa širokim rasponom simptoma kod zaraženih biljaka; zaostajanje u razvoju, žutilo, razvoj brojnih sitnih grana-izdanaka sa malim listovima, filodijima (formiranje listova nalik tkivima umjesto cvjetova), virescencija (ozelenjavanje cvjetnih organa), proliferacija (rast izbojaka iz cvjetnih organa), ljubičasti vrh (crvenilo listova i stabljike), nekroza floema (transportnog tkiva prozenhimatičnih stanica). Postoje poteškoće kod uzgoja fitoplazmi ˶in vitro˵ i genetskoj manipulaciji, ali i zbog njihovih bioloških svojstava kao što su; ograničenje na stanice floema, neprenosivost ručnom inokulacijom, visokom vektorskom specifičnošću.
Japansko društvo i prof. biljne patologije (Sveučilišta u Tokiju); izvjestilo je da se fitoplazme prenose cijepljenjem, iako je uzročnik ostao nepoznat (Shiral 1890.). Kao prijavljeni slučajevi od početka dvadesetog stoljeća kao virusne bolesti biljaka označene su na Paulowniji sp., (Kawakami 1902.)., žuta riža patuljasta bolest, (Japan), astera žuta bolest, (Kunkel) SAD. Ove bolesti su u početku smatrane virusima zbog prenošenja insektima i simptomima sličnim kao kod virusa. Međutim nakon otkrivanja pleomorfnih tijela (Doi i sur., 1967.). nalik na mikoplazme u dijelovima floema biljaka, imenovani su organizmi slični mikoplazmi (MLO); zbog njihovih morfoloških sličnosti sa mikoplazmama kao i osjetljivosti na tetraciklinske antibiotike (Ishiee i sur., 1976.). Otkriće ovih novih biljnih patogena je kasnije potvđeno u studijama (Granados i sur., 1968; Hull i sur., 1969.). Zbog nemogućnosti klasifikacije (biologije i taksonomije); svaki MLO je imenovan na temelju svog prirodnog domaćina i simptoma. Nomenklaturom od kasnih 1980-tih, gdje je nekoliko stotina MLO-a, prijavljeno na globalnoj razini, 63 u Japanu (Kishi, 1987.). Početkom 90-tih godina gen 16S rRNA sekvence MLO-a, te su također ˵uspoređene kod Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri i nekoliko mikoplazmi (Kushe i Kirkpatrick 1992., Namba i sur., 1993.). Ove analize otkrile su da su MLO monofiletska skupina unutar razreda Mollicutes, ali su bliže srodnicima Acholeoplasma spp. nego Spiroplasma spp. i mikoplazme životinja. Godine 1994. naziv ˵phytoplasmas˶ usvojio je Phytoplasma Working Team na desetom kongresu Međunarodne organizacije mikoplazmologije za zajedničko označavanje MLO. Predloženo je da su fitoplazme u novom rodu Candidatus Phytoplasma (IRPCM-The International Organization for Mycoplasmology, 2004.).
U svijetu je približno zabilježeno 40 fitoplazmatskih vrsta (Hogenhout i sur. 2008; Jung i sur. 2002, 2003b, c; Sawa yanagi i sur. 1999.). Kapacitet kukaca u stjecanju, prijenosu, preživljavanju i rasponu domaćina, izravno određuje epidemiologija fitoplazmi. Insekti koji se hrane floemom dobivaju fitoplazme od oboljelih biljaka tijekom hranjenja, koje prodiru u intestinalni dio (prva barijera), cirkuliraju u hemolimfi, ulaskom u žljezde slinovnice (druga barijera), te se razmnožavaju. U ovom trenutku insekti postaju vektori. Nakon što se hrane sa zdravim biljkama one se zaraze. Zbog mogućeg vektorski proširenja raspona domaćina i njihovih promjena fitoplazme mogu zaraziti nespecifične biljke bez pokazivanja simptoma. Kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze korištene da bi se pregledalo 227 primjeraka cikada diljem svijeta u prirodnim staništima uz prijavljenu prisutnost šest sojeva fitoplazmi, koje još nisu okarakterizirane (Trivellone i sur.). Uzorci korišteni u široko korištenoj PCR detekciji fitoplazmi sa molekularnim dijagnostičkim pristupom, pokazali su da je ukupno bilo deset primjeraka insekata koji su sadržavali fitoplazme, od kojih je devet dosad nepoznatih sojeva. Novi otkriveni sojevi fitoplazmi predstvaljali su pet novih podskupina od četiri različite ribosomske (16Sr skupine). Fitoplazme se mogu eliminirati iz biljnih domaćina s obzirom da su toplinski labilne i nisu prisutne u meristemu izbojaka (Lee i Davis, 1992.). Osjetljive su na antibiotike tetracikline (Heintz, 1989.). Primjenjeno je nekoliko metoda na čistom biljnom materijalu za fitoplazme, što je uključivalo ˶in vitro˵ kulturu tkiva kao što je vrh izbojka (Dale i Cheyne, 1993.). ili mikropropagaciju (Davies i Clark, 1994.)., a ponekad i u kombinaciji s toplinskim ili antibiotskim tretmanom.
Fitoplazmatske bolesti povrtnih kultura karakteriziraju simptomi kao što su: malo lišća, filodija, virescencija cvijeta, veliki pupoljci, deformitet biljaka, cvjetna malformacija, vaskularna diskoloracija. Fitoplazme u skupini 16SrIII induciraju simptome malog rasta, zaostajanja u razvoju, deformitet biljaka, kod različitog povrća (kupus, tikvice, krumprir, rajčica, čili paprika. Bolest velikih pupova rajčice mogla bi se povezati s različitim skupinama fitoplazme u različitim geografskim područjima. Prema istraživanjima u Turskoj uzorci rajčice bili su pozitivni kod određivanja fitoplazmi Nested-PCR i univerzalnim fitoplazmatskim 16SrRNA specifičnim početnicama. Kao simptomi navode se; grmoliki izgled biljaka rajčice, ljubičasto i smotano lišće, deformaciju pupoljaka i plodova, uvijanje i crvenilo listova, sterilnost cvjetova, smanjenje same veličine biljke (Phytoplasma solani). Kod plodova jagode, maline, kupine, borovnica, brusnice, ribizla koji se još nazivaju “superhrana” i uzgajaju se na svim kontinentima, a njihovi plodovi su također domaćini brojnih patogenih gljiva, fitoplazmi, virusa, viroida, bakterija. Zbog nutritivnih svojstava i bioaktivnog djelovanja imaju važno mjesto u ljudskoj prehrani sa povećavanjem globalne proizvodnje.
Stabla kruške u provinciji Malatya u Turskoj imala su simptome jakog crvenila, patuljast rast, proliferaciju izdanaka. PCR sekvencioniranjem potvrđena je prisutnost fitoplazmi koje su se razlikovale ovisno o domaćinu; Phytoplasma pyri, Canditatus Phytoplasma trifolli, Candidatus Phytoplasma solani. Neredovita prisutnost fitoplazmi (voćarske kulture, povrtne kulture, korovi) pokazuje njihovo kontinuirano širenje sa zaražavanjem novih usjeva, nastanjujući stalno nove horizonte. Kod vinove loze postoji karakteristična lomljivost listova, sa trokutastim, srcolikim oblicima zbog njihovog uvijanja, ovisno o sorti pojavljuju se različiti stupnjevi promjene boje razlaganjem klorofila sa pojavom pigmenata; antocijana i karotenoida. Promjene boje vide se kod bijelih sorata u različitim tonovima na nervaturi lista svjetlozelena, žuta boja do zagasita. Crne sorte imaju promjene u nijansama crvene boje svjetlo, tamno. Kod infekcije mladi dijelovi prestaju s porastom te se skraćuju internodiji, uz slabo dozrijevanje gdje mladice ostaju zeljaste sve do kraja vegetacije. Zbog nedostatka plutastog tkiva u jesenskom i zimskom periodu dolazi do smrzavanja, te se na bazalnom dijelu vide crne pustule, do potpune osušenosti. Simptomi zaraze fitoplazma na trsovima najjasnije se vide u fazi cvatnje (lipanj, srpanj), te u (kolovozu, listopadu), kada se jasno mogu determinitrati tamnozeleni listovi i svjetlozeleni koji su inficirani. Kao vektori fitoplazmi ističu se cvrčci reda Homoptera; vrste Scaphoideus titanus Ball i Hyalestehes obsoletus Signoret, osim njih prisutni su i Reptalus cuspidatus, Cicadela viridis, Cixius wagneri, Metcalfa pruinosa (Budinščak i sur. 2005.). Mjera za suzbijanje širenja fitoplazmi je sadnja zdravog i certificiranog sadnog materijala, te manje osjetljivih kultivara vinove loze.
Brzim otkrivanjem uz karakterizaciju patogena moguće je kontrolirati razvoj fitoplazmatskih bolesti. Zbog povećane međunarodne trgovine sadnim materijalom, dolazi do pojave novih patogena i njihovih varijanti. Kod malih voćnjaka brze klimatske promjene imaju također utjecaj na pojavu bolesti. Fitoplazme voćnjaka moguće je identificirati molekularnim markerima za praćenje distribucije populacije insekata vektora. Istraživanjima na genetskoj i induciranoj rezistentnosti fitoplazmi kod voćaka i vinove loze, sa razvojem inovativnih načina kontrole vektora, uz primjenu genetske otpornosti kod jabuke. Sa modelnim sustavima za proučavanje mehanizma genetske otpornosti kod stabla kruške i žutila koštićavog voća, uz pokušaje utvrđivanja genetske otpornosti vinove loze. Molekularna i histološka istraživanja na voćkama i vinovoj lozi omogućila su bolje razumijevanje reakcije biljke na infekciju fitoplazmom. Poticanje otpornosti bioaktivnim spojevima uglavnom na vinovoj lozi. Danas je kontrola vektora, insekata najučinkovitiji način za ograničenje širenja fitoplazmatskih bolesti voćaka i vinove loze. Osnovni podaci o identifikaciji vrste, populacije vektora sa ekološki prihvatljivom zaštitom bilja, repelentima, omogućavaju ne kemijsku kontrolu. Prema studiji sa Sveučilišta Bologne (Zavoda za patologiju biljaka); molekularnom karakterizacijom mikrobnih zajednica, koje su povezane sa različitim vrstama cikada-vektora, otkriven je endosimbiont Candidatus Sulcia muelleri, uz dobivene sekvence genoma više različitih fitoplazmi.
Petra Vinceković dipl.ing.agr, Doktoranda
